高GC高保真酶-友名生物公司

低嚴(yán)格單鏈特異性引物pcr (lowstringencysingle specific primer pcr， lssp- pgr)技術(shù)
lssp - pcr是建立在pcr基礎(chǔ)上的又一種新型*突變檢測(cè)技術(shù)。要求是“二高一低”。高濃度的單鏈引物( 5-端/ 3-端引物均可).約4. 8lmol高濃度的taq酶( 16lmol/ 100ml) 低退火溫度( 300.所用的模板必須是純化的dna部分片段。在這種低嚴(yán)格條件下。引物與模板間發(fā)生不同程度的錯(cuò)配。形成多種大小不同的擴(kuò)增產(chǎn)物。經(jīng)電泳分離后形成不同的帶型。對(duì)同一目的*而言。所形成的帶型是固定的。因而稱(chēng)之為“*標(biāo)簽”。這是一種檢測(cè)*突變或進(jìn)行遺傳鑒定的快速敏感方法。
反向pcr( inverse pcr， ipcr術(shù)
原理:反向pcr是克1隆已知序列旁側(cè)序列的一種方法，主要原理是用一種在已知序列中無(wú)切點(diǎn)的限制性?xún)?nèi)切酶消化*組dna.后酶切片段自身環(huán)化.以環(huán)化的dna作為模板，用一對(duì)與已知序列兩端特異性結(jié)合的引物，擴(kuò)增夾在中間的未知序列。該擴(kuò)增產(chǎn)物是線性的dna的部分片段，大小取決于.上述限制性?xún)?nèi)切酶在已知基閑側(cè)翼dna序列內(nèi)部的酶切位點(diǎn)分布情況。用不同的限制性?xún)?nèi)切酶消化，可以得到大小不同的模板dna，再通過(guò)反向pcr獲得未知片段。
該方法的不足是:①需要從許多酶中選擇限制酶，高gc高保真酶，或者說(shuō)必須選擇一種合適的酶進(jìn)行酶切才能得到合理大小的dna部分片段。這種選擇不能在非酶切位點(diǎn)切斷靶dna。②大多數(shù)有核*組含有大量中度和高度重復(fù)序列，而在yac或co*id中的未知功能序列中有時(shí)也會(huì)有這些序列，這樣，通過(guò)反向pcr得到的探針就有可能與多個(gè)*序列雜交。
巢式pcr(nest pcr枝術(shù).
先用一對(duì)靶序列的外引物擴(kuò)增以提高模板量.然后再用一對(duì)內(nèi)引物擴(kuò)增以得到特異的pcr帶。此為巢式pcr。若用一條外引物作內(nèi)引物則稱(chēng)之為半巢式pcr。為減少 巢式pcr的操作步驟可將外引物設(shè)計(jì)得比內(nèi)引物長(zhǎng)些，且用量較少。同時(shí)在第yi次pcr時(shí)采用較高的退火溫度而第二次采用較低的退火溫度。這樣在第yi次pcr時(shí)，由于較高退火溫度下內(nèi)引物不能與模板結(jié)合，故只有外引物擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)若干次循環(huán)。待外引物基本消耗盡，無(wú)需取出第yi次pcr產(chǎn)物，只需降低退火即可直接進(jìn)行pcr擴(kuò)增。這不僅減少操作步驟。同時(shí)也降低了交叉污染的機(jī)會(huì)。這種pcr稱(chēng)中途進(jìn)退式pcr( drop-in， drop-out pcr)上述三種方法主要用于少量dna模板的擴(kuò)增。
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